蛋白质相互作用质谱分析

在过去的几十年中，以质谱(MS)为基础的蛋白质组学已经成为鉴定蛋白质-蛋白质相互作用分析(PPIs)的重要技术。蛋白质通过与其它蛋白质或化合物相互作用，形成大分子化合物，从而发挥生物学功能。对蛋白质相互作用的研究能够帮助我们更好的理解蛋白质。当通过IP, CO IP或GST pull-down等蛋白质相互作用分析手段，获得靶标蛋白后，通过质谱分析方法对该蛋白进行分析，鉴定及定量，能够对相互作用蛋白进行表征，进一步对蛋白质功能进行分析。亲和纯化结合质谱分析（Affinity purification combined with mass spectrometry, AP-MS）则允许在特定生理条件下无偏差的对相互作用蛋白进行检测。一种做法是利用SILAC方法分别标记实验组和对照组细胞后进行Co-IP实验，依靠抗原与抗体之间的专一性反应分离得到免疫复合物；再通过LC-MS/MS来定性/定量检测免疫复合物中的蛋白；当实验组与对照组中某个蛋白质的含量达到统计学差异时，判定这个蛋白质与研究的蛋白具有相互作用，可极大降低蛋白质互作假阳性结果可能性。SILAC技术和Co-IP-MS技术结合可用于高通量定量分析在特定情况下蛋白的互作蛋白网。

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免疫共沉淀法（CO-IP）结合质谱联用的蛋白互作分析
对Pull-down实验捕获到的细胞中相互作用较低弱丰度低的靶蛋白进行质谱鉴定：GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋白互作分析
用于高通量定量分析在特定生理条件下蛋白的互作蛋白网络分析：SILAC与免疫共沉淀结合质谱联用的蛋白互作分析

质谱鉴定相互作用蛋白的两个常用方法是肽指纹图谱分析法（peptide fingerprinting）和鸟枪法蛋白质组学分析法（shot-gun proteomics）。肽指纹图谱分析法，通过SDS-PAGE，对蛋白样品进行分离。聚丙烯酰胺凝胶可以是考马斯亮蓝（coomassie）和银染条带。但是需要样品条带是单一条带，即只含有一个蛋白条带。将切下来的蛋白条带用酶进行消化后，通过质谱进行分析。这些消化后得到的肽段进行质谱分析后，通过与理论数据库进行比对的方式，生物信息学分析拼接得到目的蛋白的信息。肽指纹图谱法的一些局限性在于，该方法需要在切胶过程中得到单一的蛋白条带，如果有杂带将会影响检测的准确性，因为杂带中的蛋白信息可能会掩盖真实的目的蛋白的信息。因此比较适用于较纯的蛋白样品的鉴定。而鸟枪法蛋白质组学分析法的强大之处在于，鸟枪法可以对蛋白混合物进行分析。

鸟枪法蛋白质组学的原理是先将蛋白质样品消化成肽段，然后将肽段通过高效液相色谱(HPLC)法进行分离。分离后的肽段直接进入质谱仪进行分析。质谱分析包括了两个过程，一级质谱（MS1）及二级质谱(MS2)。一级质谱获取高校液相色谱MS1中洗脱的肽的质量-电荷比（m/z）和肽的强度（intensity）；二级质谱通过对肽段氨基酸序列进行确定，MS2选择单个肽段对其进行萃裂从而得到该肽段的光谱数据。检索软件根据二级质谱信息与相应的数据库比对，结合匹配度打分及错配过滤，可得到肽段的确切序列，进而拼接出各蛋白的完整序列，从而实现对蛋白的鉴定。

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